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    ELISA試劑盒試驗抗體的制備辦法

    發(fā)布時間: 2018-06-12  點擊次數(shù): 1659次

    ELISA試劑盒途徑的挑選決定于抗原的生物學(xué)特性和理化特性,如激素、酶、毒素等生物學(xué)活性抗原,通常不宜選用靜脈打針。
    不一樣個別對共同抗原的反響性不一樣,并且不一樣抗原發(fā)生免疫反響的才能也有強有弱,因而常常在打針抗原的一起,參加能增強抗原的抗原性物質(zhì),以影響機體發(fā)生較強的免疫反響,這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。
    免疫前取等容積*或不*佐劑與免疫原溶液混合,用振蕩器混勻成乳狀,也可以在免疫前取需求量佐劑置乳缽中研磨,均勻后再邊磨邊滴參加等容積抗原液(其中加卡介苗3~4mg/ml或不加),加完后再承繼研磨成乳劑,滴于冰水上5~10min內(nèi)*不渙散中止。
    穿插反響率低,標(biāo)明抗血清的特異性好,反之則特異性差。
    搜集的血液置于室溫下1h分配,凝集后,置4℃下,過夜(切勿冰凍)分出血清,離心,4000rpm,10min。
    取兔血有兩種辦法,一是耳緣靜脈或耳動脈放血,二是頸動脈入血,也可心臟采血。加強免疫時用不*佐劑,初度免疫時皮下打針百日咳疫苗0.5ml,加強免疫時不用打針百日咳疫苗。
    在無菌條件,吸出血清,分裝(0.05~0.2ml),貯于-40℃以下冰箱,或凍干后儲存。
    取動脈或靜脈放血時,將兔放入一個特造的木匣或籠內(nèi),耳露于箱(籠)外,也可由另一人抓住兔身。
    防止扔掉抗原,亦可用一打針器裝抗原液,另一打針器裝佐劑,二者以聚乙烯塑料管聯(lián)接,然后二者往復(fù)重復(fù)抽吸,約數(shù)十分鐘后即能*乳化。
    每2~3周加強免疫一次。
    制作辦法:按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi),用超聲波使之混勻,高壓滅菌,置4℃下保存?zhèn)溆谩?br />ELISA試劑盒特異性是以穿插反響率來標(biāo)明的。
    ELISA試劑盒穿插反響率通常是用競賽按捺曲線來斷定的。
    若用兔,用純種新西蘭兔,一組三只,兔的體重以2~3kg為宜。
    家兔是zui常用以發(fā)生抗體的動物,因而這兒首要議論兔血的搜集。
    頸動脈放血時,將兔仰臥,固定于兔臺,剪去頸部的毛,切開肌膚,暴露頸動脈,插管,放血。
    不一樣濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)別離做競賽按捺曲線,核算各自的聯(lián)絡(luò)率(B/T或B/B0),求出各清閑IC50時的濃度,按下列公式核算穿插反響率。二禮拜后,可在另一耳放血。
    此法可重復(fù)屢次放血。
    作免疫用的動物有哺乳類和禽類,首要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等,試驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。
    在第2次加強免疫后2周,從耳緣靜脈取2~3ml血,制備血清,查看抗體效價。羊等較大動物以頸靜脈、動脈取血,鼠等小動物取血可參看有關(guān)資料。
    剪去耳緣的毛,用少量二甲苯涂抹耳廓,30s后,耳血管擴(kuò)大、充血。用手輕拉耳尖,以單面剃須刀或尖的手術(shù)刀片,靈敏切開動脈或靜脈,血液即流出,每次可搜集30~40ml。
    抗原劑量,初度劑量為300~500μg,加強免疫的劑量約為初度劑量為1/4分配。
    C冰箱保存。查看合格后即以其中一打針器作打針用。
    佐劑除了延伸抗原在體內(nèi)的存留時間,添加抗原影響作用外,更首要的是,它能影響網(wǎng)狀內(nèi)皮體系,使介入免疫反響的免疫活性細(xì)胞增多,推動T細(xì)胞與B細(xì)胞的彼此作用,然后增強機體對抗原的細(xì)胞免疫和抗體的發(fā)生。
    ELISA試劑盒未到達(dá)預(yù)期效價,需再進(jìn)行加強免疫,直到滿意時中止。

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